Herausgegeben von Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, Kalifornien, genehmigt am 25. Dezember 2020 (überprüft am 25. Oktober 2020)
Wir berichten über die Interaktion zwischen Untereinheiten bei der Replikation von Coronaviren-Transkriptionskomplexen, die für die Replikation und die evolutionäre Erhaltung wesentlich sind.Wir lieferten Beweise dafür, dass die mit nsp12 assoziierte NiRAN-Domäne eine Nukleosidmonophosphat (NMP)-Transferase-Aktivität in trans aufweist, und identifizierten nsp9 (ein RNA-bindendes Protein) als ihr Ziel.NiRAN katalysiert die kovalente Bindung der NMP-Einheit an den konservierten nsp9-Aminoterminus in einer Reaktion, die auf Mn2+-Ionen und benachbarten konservierten Asn-Resten beruht.Es wurde festgestellt, dass die NiRAN-Aktivität und die NSP9-NMPylierung für die Coronavirus-Replikation wesentlich sind.Die Daten ermöglichen es uns, diese Aktivität des Nested-Virus-Enzymmarkers mit den vorherigen Beobachtungen in der Hypothese zu verknüpfen, dass die Initiierung der RNA-Synthese in einer Klasse von RNA-Viren funktionell und evolutionär konsistent ist.
Die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRps) von Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae und 12 anderen Familien) ist mit der Amino-terminalen (N-terminalen) Domäne im nichtstrukturellen Protein (nsp) verknüpft, das vom Polyprotein freigesetzt wird und NiRAN genannt wird 1ab besteht aus viraler Hauptprotease (Mpro).Zuvor wurde über die eigene GMPylierungs-/UMPylierungsaktivität des arteriellen Virus NiRAN-RdRp nsp berichtet und vorgeschlagen, einen Übergang für die Übertragung von Nukleosidmonophosphat (NMP) auf das (derzeit unbekannte) Virus und/oder die Zellbiopolymerisation zu erzeugen.Hier zeigen wir, dass das Coronavirus (Humanes Coronavirus [HCoV]-229E und Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) eine Mn2+-abhängige NMPylierungsaktivität aufweist, die von nsp9 durch die Bildung von Mpro-vermitteltem nsp9 After abgeleitet ist Das N-terminal flankierende NSP9 wird proteolytisch freigesetzt, das Phosphoramidat wird an das primäre Amin (N3825) am N-Terminus von NSP9 gebunden.Uridintriphosphat ist das bevorzugte Nukleotid in dieser Reaktion, aber auch Adenosintriphosphat, Guanosintriphosphat und Cytidintriphosphat sind geeignete Cosubstrate.Mutationsstudien mit rekombinanten Coronavirus-nsp9- und nsp12-Proteinen und gentechnisch veränderten HCoV-229E-Mutanten bestimmten die für die NiRAN-vermittelte nsp9-NMPylierung und Virusreplikation in der Zellkultur erforderlichen Reste.Die Daten bestätigten die Vorhersage von NiRAN-Resten im aktiven Zentrum und bestimmten die wichtige Rolle der N3826-Reste von nsp9 bei der NMPylierung von nsp9 und der Virusreplikation in vitro.Dieser Rest ist Teil der konservierten N-terminalen NNE-Tripeptidsequenz und erwies sich als der einzige invariante Rest von nsp9 und seinen Homologen in der Coronavirus-Familie.Diese Studie bietet eine solide Grundlage für die funktionelle Untersuchung der NMPylierungsaktivität anderer verschachtelter Viren und schlägt mögliche Ziele für die Entwicklung antiviraler Medikamente vor.
Das positivsträngige RNA-Virus Nidovirales infiziert eine Vielzahl von Wirbeltieren und Wirbellosen (1, 2).Der Orden umfasst derzeit 14 Familien (3), von denen die Coronavirus-Familie in den letzten 20 Jahren umfassend untersucht wurde.Damals gingen drei zoonotische Coronaviren aus tierischen Wirten hervor und verursachten beim Menschen großflächige Ausbrüche schwerer Atemwegsinfektionen.Einschließlich anhaltender Pandemien, die durch schwere akute Infektionskrankheiten verursacht werden.Respiratorisches Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidoviren haben eine gemeinsame Genomorganisation und die Untereinheit des membrangebundenen Replikations-Transkriptions-Komplexes (RTC) ist in den 5-?²-terminalen zwei Dritteln und der Hauptstrukturuntereinheit des Viruspartikels sowie einigen Zubehörteilen kodiert .Protein, kodiert im 3??²-Enddrittel des Genoms (1).Mit Ausnahme einer Familie von Planarienviren (Monoviridae) (8) kodieren alle verschachtelten Viren RTC-Untereinheiten in zwei großen offenen Leserahmen (ORF) ORF1a und ORF1b, die aus genomischer RNA von translatiert werden.ORF1a kodiert für das Polyprotein (pp) 1a, und ORF1a und ORF1b kodieren gemeinsam für pp1ab.Unter allgemeiner Beteiligung der von ORF1a kodierten Hauptprotease (Mpro) werden sowohl pp1a als auch pp1ab proteolytisch in eine Vielzahl von Nichtstrukturproteinen (nsps) verarbeitet, die auch als 3CLpro bekannt sind, da sie Homologie mit dem 3Cpro des Picornavirus aufweisen ( 9).Es wird angenommen, dass diese NSPs zu einem großen dynamischen RTC zusammengesetzt werden, die Synthese genomischer RNA (Replikation) und eines Satzes subgenomischer RNA (Transkription) katalysieren und zur Koordinierung der Expression des ORF verwendet werden, der sich stromabwärts von ORF1b befindet (10? ? ?12).
Das Kern-RTC umfasst die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp) (13), die Helikase der Superfamilie 1 (HEL1) (14, 15) und mehrere RNA-verarbeitende Enzyme, die hauptsächlich in ORF1b und in der Coronavirus-Familie kodiert sind. Es enthält nsp12-nsp16 und nsp9-nsp12 in der Familie Arterioviridae (siehe Referenz 10ââ 12).RdRp und HEL1 stellen zwei (ein Fünftel) konservierte Domänen des Vogelnestvirus dar und weisen Homologie zu anderen RNA-Viren auf.Es wird angenommen, dass die Kernreplikase durch andere Untereinheiten unterstützt wird, darunter mehrere kleine NSPs, die aus der carboxyterminalen (C-terminalen) Region von pp1a, stromabwärts von Mpro (Coronavirus NSP5 bzw. Arterienvirus NSP4), freigesetzt werden.Sie verfügen über begrenzten familienspezifischen Schutz und vielfältige Aktivitäten (siehe Referenz 10ââ12).
Vor relativ kurzer Zeit wurde in allen verschachtelten Viren eine Domäne mit einzigartigen Sequenzmotivmerkmalen am Aminoterminus (N-Terminus) neben RdRp gefunden, jedoch in keinem anderen RNA-Virus (16).Aufgrund ihrer Lage und der Aktivität der Nukleotidtransferase (Nukleosidmonophosphat [NMP]-Transferase) wird diese Domäne NiRAN (Nestvirus RdRp-verwandte Nukleotidtransferase) genannt.Die Dual-Domänen-Kombination von NiRAN-RdRp stellt nsp12 in der Familie der Coronaviridae und nsp9 in der Familie der Arterioviridae dar, und bei anderen Nestoviridae wird erwartet, dass NiRAN-RdRp als unabhängiges NSP vom viralen Polyprotein freigesetzt wird.Im Coronavirus enthält die NiRAN-Domäne 1/450 Reste und ist über die Linkerregion (16–19) mit der C-terminalen RdRp-Domäne verbunden.Im Equinen Arteritis-Virus (EAV) (Arteriviridae) zeigt rekombinantes nsp9 Mn2+-Ionen-abhängige (selbst-) UMPylierungs- und GMPylierungsaktivitäten, die von drei konservierten Sequenzbasen im Nestovirus, AN, BN und CN, den Resten in der Sequenz, abhängen.Wobei N für NiRAN steht) (16).Die N-terminale Flanke dieser Motive ist ein weniger konservatives Motiv vor AN.Einige dieser Reste sind auch in entfernt verwandten Proteinkinasen konserviert, wo sie nachweislich an der Bindung von Nukleosidtriphosphat (NTP) und der katalytischen Aktivität beteiligt sind (20, 21).In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung können mehrere wichtige Reste des aktiven Zentrums in der Pseudokinase SelO aus Pseudomonas syringae mit dem kürzlich veröffentlichten SARS-CoV-2-Superkomplex nsp7/8/12/13 zusammengesetzt werden.Konservierte NiRAN-Reste des Coronavirus, überlagert in der Elektronenmikrostruktur.Rekombinantes Protein (17).Es wird spekuliert, dass die dokumentierte (Selbst-)U/GMPylierung einen Übergangszustand erzeugen wird, um NMP auf das (derzeit unbekannte) Substrat zu übertragen (16), und die strukturelle Ähnlichkeit zwischen NiRAN und Proteinkinase (17, 19) ist die Hypothese, dass NiRAN verändert andere Proteine.
Viele Merkmale, einschließlich seiner einzigartigen und einzigartigen systematischen Assoziation mit verschachtelten Viren und der genetischen Trennung von RdRp, machen NiRAN zu einem sinnvollen Schlüsselenzym für die Regulierung verschachtelter Viren, das für deren Entstehung und Identität von entscheidender Bedeutung ist.Zuvor wurden drei mögliche Funktionen von NiRAN zur Regulierung der Genom-/subgenomischen Translation oder Replikation/Transkription genannt.Angesichts der damals spärlichen und unvollständigen Datenlage hat jede Funktion ihre Vor- und Nachteile (16).In dieser Forschung wollen wir die biochemischen und umgekehrten genetischen Studien der Coronaviren, die die beiden Gattungen repräsentieren, kombinieren und unsere Erkenntnisse in den evolutionären Hintergrund der natürlichen Mutation der Coronavirus-Familie stellen, um Einblicke in dieses mysteriöse Reich zu gewinnen.Wir berichten über große Fortschritte beim Verständnis von NiRAN durch die Identifizierung natürlicher Ziele in RTC, was (unter den drei verfügbaren Hypothesen) zur Rolle dieser Domäne bei der Initiierung der Synthese verschachtelter Virus-RNA beiträgt.Diese Forschung eröffnet auch Möglichkeiten für andere Rollen von NiRAN an der Virus-Host-Schnittstelle.
Um die enzymatischen Eigenschaften der mit dem Corona-Virus nsp12 verwandten NiRAN-Domäne zu charakterisieren, produzierten wir eine rekombinante Form des humanen Coronavirus 229E (HCoV-229E) nsp12 in E. coli mit einem His6-Tag am C-Terminus und kombinierten diese Protein mit [α32-P] Zusammen mit NTP in Gegenwart von MnCl2 inkubieren, wie in Materialien und Methoden beschrieben.Die Analyse des Reaktionsprodukts zeigte das Vorhandensein eines radioaktiv markierten Proteins, das mit nsp12 (106 kDa) mitwandert, was darauf hindeutet, dass das Coronavirus nsp12 die Bildung kovalenter Protein-NMP-Addukte katalysiert, die vorzugsweise mit Uridinmonophosphat (UMP) gebildet werden (Abbildung 1A). B).Die quantitative Analyse zeigte, dass die Signalintensität des UMP-Einbaus im Vergleich zu anderen Nukleotiden um das Zwei- bis Dreifache zunahm (Abbildung 1C).Diese Daten stimmen mit der vorhergesagten NMP-Transferaseaktivität der NiRAN-Domäne des Coronavirus überein (16), weisen jedoch darauf hin, dass die Nukleotidpräferenzen der NiRAN-Domäne des Coronavirus und des arteriellen Virus unterschiedlich sind.
Selbst-NMPylierungsaktivität von HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) wurde mit dem bezeichneten [α-32P] NTP in Gegenwart von 6 mM MnCl2 30 Minuten lang inkubiert (Einzelheiten siehe Materialien und Methoden).Die Reaktionsprodukte wurden durch SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie-Brillantblau angefärbt.(B) Das radioaktiv markierte Protein wird durch Phosphorbildgebung sichtbar gemacht.Die Positionen von nsp12-His6 und Protein-Molekularmassenmarkern (in Kilodalton) sind in A und B dargestellt. (C) Die Intensität des radioaktiven Signals (Mittelwert ± SEM) wurde aus drei unabhängigen Experimenten bestimmt.*P≤0,05.Die Signalstärke (Prozentsatz) hängt mit UTP zusammen.
Obwohl gezeigt wurde, dass NiRAN-bezogene Enzymaktivitäten für die Replikation von EAV und SARS-CoV in Zellkulturen essentiell sind (16), wurden die spezifische NiRAN-Funktion und mögliche Ziele noch nicht bestimmt.Die kürzlich berichtete strukturelle Ähnlichkeit zwischen NiRAN und einer Familie von Proteinen mit Proteinkinase-ähnlichen Faltungen (17, 22) veranlasste uns, die Hypothese zu testen, dass NiRAN die NMPylierung anderer Proteine katalysiert.Wir haben eine Reihe potenzieller homologer Ziele generiert, darunter nichtstrukturelle Proteine, die von HCoV-229E ORF1a kodiert werden (nsps 5, 7, 8, 9, 10), die jeweils einen C-terminalen His6-Tag enthalten (SI-Anhang, Tabelle S1). Inkubieren Sie diese Proteine mit [α32-P]-Uridintriphosphat ([α32-P]UTP) in Gegenwart oder Abwesenheit von nsp12.Als Kontrollen dienten Rinderserumalbumin und MBP-LacZα-Fusionsprotein, hergestellt in E. coli (Abbildung 2A, Spuren 1 bis 7).Das radioaktiv markierte Protein wurde durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Autoradiographie analysiert und es wurde festgestellt, dass es in der Reaktion, die nsp12 und nsp9 enthielt, ein starkes radioaktives Signal gab.Die Position des Signals entspricht der Molekülmasse von nsp9, was auf eine durch Nsp12 vermittelte UMPylierung von nsp9 hinweist (Abbildung 2B, Spur 7).Es wurde keine UMPylierung anderer Testproteine festgestellt, was uns zu dem Schluss führte, dass nsp9 ein spezifisches Substrat von nsp12 ist.In Übereinstimmung mit den in Abbildung 1 gezeigten Selbst-NMPylierungsdaten ist nsp12 in der Lage, alle vier NMPs auf nsp9 zu übertragen, obwohl die Effizienz unterschiedlich ist: UMP > Adenosinmonophosphat (AMP) > Guanosinmonophosphat (GMP) > Cytidinmonophosphat (CMP) ) ( Bild).3 A und B).Unter den in diesem Test verwendeten Bedingungen (Reaktions- und Expositionszeit verkürzen, Konzentration von nsp12 verringern; Materialien und Methoden) konnte die Selbst-NMPylierung von nsp12 nicht nachgewiesen werden (vergleiche Abbildung 2B, Spur 7 und Abbildung 1B). erwies sich als effektiv (und mehrere Runden) UMP wurde von nsp12 auf nsp9 verschoben.Die UMP-Transferase-Aktivität erfordert die Anwesenheit von Mn2+-Ionen, wie in Abbildung 3C gezeigt, während in Gegenwart von Mg2+ nur eine minimale UMP-Transferase-Aktivität und in Gegenwart der anderen beiden getesteten zweiwertigen Kationen keine Aktivität beobachtet wurde.Ähnliche Daten wurden in NMPylierungsassays mit Cytidintriphosphat (CTP), Guanosintriphosphat (GTP) und Adenosintriphosphat (ATP) erhalten (SI-Anhang, Abbildung S1).
HCoV-229E nsp12-vermittelte UMPylierung von nsp9.Eine Reihe von Proteinsubstraten (einschließlich Rinderserumalbumin, MBP-lacZα und eine Reihe von HCoV-229E-nsps, markiert mit C-terminalem His6, kodiert durch ORF1a) wurden verwendet, um die UMPylierungsaktivität von HCoV-229E nsp12-His6⁺-vermittelt zu bewerten Eiweiß.Inkubieren Sie das Protein mit [α-32P] UTP für 10 Minuten in Abwesenheit (A) oder Anwesenheit (B) von nsp12, wie in den Materialien und Methoden beschrieben.Oben in A und B ist mit Coomassie Brilliant Blue gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel dargestellt, und unten in A und B sind die entsprechenden Autoradiogramme dargestellt.Links ist die Position des Molekularmassenmarkers des Proteins (in Kilodalton) angegeben.Die Position von nsp12-His6 (B, oben) und das radioaktive Signal, das während der Inkubation von nsp12-His6 mit nsp9-His6 (B, Spur 7) beobachtet wurde, sind ebenfalls angegeben, was darauf hinweist, dass [α-32P]UMP zu nsp9-His6 (12,9 kDa), was bei anderen getesteten Proteinen nicht beobachtet wurde.
HCoV-229E NiRAN-vermittelte biochemische und virologische Charakterisierung der nsp9-NMPylierung.(A und B) Die Rolle des bei der Reaktion verwendeten Nukleotid-Cosubstrats.Nsp12-His6 und nsp9-His6 werden gemischt und in Gegenwart verschiedener [α-32P]-NTPs im Standard-NMPylierungsassay inkubiert.(A, oben) Coomassie-gefärbtes nsp9-His6, getrennt durch SDS-PAGE.(A, unten) Autoradiographie desselben Bereichs des Gels.(B) Die relative Aktivität (Mittelwert ± SEM) in Gegenwart des bezeichneten Nukleotid-Cofaktors wird aus drei unabhängigen Experimenten bestimmt.*P≤0,05.(C) Die Rolle von Metallionen.Dargestellt ist der Standard-NMPylierungstest in Gegenwart von [α-32P]UTP und verschiedenen Metallionen, jeweils mit einer Konzentration von 1 mM.In C (oben) ist Coomassie-gefärbtes nsp9-His6 dargestellt, und in C (unten) ist die entsprechende Autoradiographie dargestellt.Die Größe des markierten Proteins (in Kilodalton) wird links von A und C angezeigt. (D) Die mutierte Form von HCoV-229E nsp12-His6 mit der angegebenen Aminosäuresubstitution liegt wie beschrieben in [α-32P]UTP vor in Materialien und Methoden.Das in der NMPylierungsreaktion produzierte radioaktiv markierte nsp9-His6 wird durch Phosphorylierungsbildgebung nachgewiesen (D, oben).Die relative Aktivität im Vergleich zum Wildtyp-Protein (wt) ist in D dargestellt, und der untere Wert ist der Durchschnitt (± SEM) aus drei unabhängigen Experimenten.Sternchen kennzeichnen Substitutionen nicht konservierter Reste.(E) Der Virustiter im Kulturüberstand von p1-Zellen, der 24 Stunden nach der Infektion erhalten wurde, wurde durch Plaque-Assay bestimmt.Die Codon-Substitutionen in der NiRAN-Domäne des manipulierten HCoV-229E-Mutanten sind angegeben (die Nummerierung der Reste basiert auf ihrer Position in pp1ab).Als Kontrolle wurde die replikationsdefiziente RdRp-Aktivstellenmutante nsp12_DD4823/4AA verwendet.
Um ein tieferes Verständnis des aktiven Zentrums von NiRAN zu erlangen und die Reste zu bestimmen, die mit der Aktivität der nsp9-spezifischen NMP-Transferase zusammenhängen, führten wir eine Mutationsanalyse durch, bei der wir die konservativen Reste in den AN-, BN- und CN-Motiven von NiRAN ersetzten ( 16) Es ist Ala (SI-Anhang, Abbildung S2).Darüber hinaus wurde in zwei Fällen der Einfluss konservativer Arg-zu-Lys- oder Lys-zu-Arg-Substitutionen bewertet.Als (Negativ-)Kontrolle werden Reste, die in der NiRAN-Domäne von Coronaviren und anderen verschachtelten Viren nicht oder weniger konserviert sind, durch Ala ersetzt. Ersetzt werden K4116A (im Motiv preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (Motiv). BN) und D4280A (CN) reduzieren die NMPylierung von nsp9 durch nsp12 erheblich oder eliminieren sie sogar, während Proteine mit konservativen Substitutionen (R4178K, K4116R) 60 % bzw. 80 % ihrer Aktivität behalten, was auf eine Lockerung der Beschränkungen auf ihrer jeweiligen Seite hinweist Ketten ist physikalisch-chemisch empfindlich (Abbildung 3D).Das Ersetzen mehrerer anderer konservierter Reste E4145A, D4273A, F4281A und D4283A ist viel weniger schädlich und die nsp9-UMPylierung wird nur mäßig reduziert.Ähnliche Ergebnisse wurden bei nsp9-NMPylierungsreaktionen mit anderen NTPs erhalten (Abbildung 3D und SI-Anhang, Abbildung S3), was bestätigt, dass die beobachteten Auswirkungen auf spezifische Aminosäuresubstitutionen unabhängig von der Art des verwendeten Nukleotid-Cosubstrats sind.Als nächstes testeten wir den möglichen Einfluss dieser nsp12-Substitutionen auf die Replikation von Coronaviren in Zellkulturen.Zu diesem Zweck verwendeten wir geeignete gentechnisch veränderte komplementäre DNA (cDNA)-Matrizen, die in rekombinantes Vacciniavirus (23, 24) geklont wurden, um 5–7 Zellen zu transkribieren.Die Titration der in diesen Zellen produzierten infektiösen Virusnachkommen zeigte, dass die meisten HCoV-229E-NiRAN-Mutanten nicht machbar waren (Abbildung 3E).Eine Gruppe nicht lebensfähiger Virusmutanten umfasst Alternativen, die nachweislich die NMP-Transferaseaktivität in vitro eliminieren oder erheblich reduzieren (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), es gibt jedoch zwei weitere Alternativen (K4116R, E4145A) 80 % reserviert?Ihre In-vitro-NMPylierungsaktivität legt nahe, dass zusätzliche Einschränkungen damit verbunden sind.In ähnlicher Weise produzierten zwei weitere Mutationen (R4178K, F4281A), die eine moderate Abnahme der In-vitro-NMPylierungsaktivität von NiRAN verursachten, lebende Viren, diese Viren reduzierten jedoch die Titer durch Replikation erheblich.In Übereinstimmung mit den in Abbildung 3D gezeigten In-vitro-Aktivitätsdaten führte das Ersetzen von vier anderen Resten, die nicht im Coronavirus und/oder anderen verschachtelten Viren (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) konserviert sind, zu lebensfähigen Viren ein mäßig reduzierter Titer im Vergleich zum Wildtyp-Virus (Abbildung 3E).
Um zu untersuchen, ob die NiRAN-vermittelte NMP-Transferaseaktivität von der aktiven RdRp-Domäne abhängt, wurden die beiden konservierten Asp-Reste, die an der Koordination zweiwertiger Metallionen (11) im RdRp-Motiv C beteiligt sind, durch Ala ersetzt. Das resultierende Protein nsp12_DD4823/4AA bleibt erhalten seine NSP9-NMPylierungsaktivität, was darauf hinweist, dass die NSP12-vermittelte In-vitro-NSP9-NMPylierungsaktivität keine Polymeraseaktivität erfordert (SI-Anhang, Abbildung S4).
Nachdem wir die NSP9-spezifische NMP-Transferaseaktivität für NSP12 ermittelt hatten, versuchten wir, das NMP-NSP9-Addukt durch Massenspektrometrie (MS) zu charakterisieren.Das vollständige Proteinmassenspektrum von rekombinantem HCoV-229E nsp9 zeigte einen Peak bei 12.045 Da (Abbildung 4A).Die Zugabe von nsp12 veränderte die Qualität von nsp9 nicht, was darauf hindeutet, dass nsp12 und nsp9 unter den verwendeten Bedingungen (Denaturierung) keinen stabilen Komplex bilden würden (Abbildung 4A).In Gegenwart von UTP und GTP zeigte die Massenmessung der Reaktion mit nsp9 bzw. nsp12, dass sich die Proteinmasse von UTP um 306 Da und die Proteinmasse von GTP um 345 Da bewegte, was darauf hinweist, dass jedes nsp9-Molekül ein UMP oder GMP bindet (Bild 4) C und D).Es wird spekuliert, dass die für die NiRAN-vermittelte NSP9-NMPylierung erforderliche Energie aus der NTP-Hydrolyse und der Pyrophosphatfreisetzung stammt.Obwohl bei dieser Reaktion ein 10-facher molarer Überschuss an nsp9 (Ziel) gegenüber nsp12 (Enzym) verwendet wurde, wurde eine nahezu vollständige NMPylierung von nsp9 beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung zwischen nsp12 und nsp9 nur von kurzer Dauer ist und nsp12 mehr nsp9 NMPylieren kann In-vitro-Molekül.
Einzelne NMPylierung von nsp9 in Gegenwart von nsp12 und UTP oder GTP.Dargestellt ist das entfaltete vollständige Proteinmassenspektrum von HCoV-229E nsp9 (SI-Anhang, Tabelle S1) (AD).(A) nsp9 allein, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 in Gegenwart von UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 in Gegenwart von GTP.
Um die von nsp12 UMPylierten nsp9-Reste zu bestimmen, wurde nsp9-UMP mit Trypsin gespalten.Die resultierenden Peptide wurden mittels Nano-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) aufgetrennt und mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) online analysiert.Die Datenanalyse mit dem Byonic-Softwarepaket (Protein Metrics) zeigte eine UMPylierung der N-terminalen Aminosäure.Dies wird manuell bestätigt.Das Tandem-Massenspektrum des Vorläuferpeptids [UMP]NNEIMPGK (SI-Anhang, Abbildung S5A) zeigte ein Fragment bei 421 m/z, was darauf hinweist, dass UMP an Rest 1 von nsp9 bindet.
Am N-Terminus von nsp9 ist Asn unter den Mitgliedern von Orthocoronavirinae konserviert (SI-Anhang, Abbildung S6).Obwohl wir glauben, dass der N-terminale primäre Aminstickstoff der wahrscheinlichste Akzeptor für UMP ist, haben wir uns entschieden, zusätzliche Beweise für die NMP-Bindung am N-Terminus zu erhalten.Aus diesem Grund wurde das durch HPLC gereinigte nicht-NMPylierte und NMPylierte N-terminale Peptid nsp9 in Gegenwart von Aceton und Natriumcyanoborhydrid abgeleitet.Unter diesen Bedingungen können nur freie primäre Amine mit Propyl (25) modifiziert werden.Das N-terminale, von nsp9 abgeleitete Peptid mit der Sequenz NNEIMPGK enthält zwei primäre Amine, eines am N-Terminus von Asn und das andere an der Seitenkette von Lys am C-Terminus.Daher können an beiden Enden Propylgruppen eingeführt werden.Die extrahierten Ionenchromatogramme nicht-NMPylierter Peptide sind im SI-Anhang, Abbildung S5B, dargestellt.Wie erwartet können N-terminale und C-terminale (mono)propylierte (SI-Anhang, Abbildung S5B, obere Spur) und dipropylierte Peptide (SI-Anhang, Abbildung S5B, untere Spur) identifiziert werden.Dieses Muster ändert sich mit der Verwendung des NMPylierten N-terminalen Peptids von nsp9.In diesem Fall können nur C-terminale propylierte Peptide identifiziert werden, N-terminale propylierte Peptide und dipropylierte Peptide werden jedoch nicht identifiziert (SI-Anhang, Abbildung S5C), was darauf hinweist, dass UMP auf das N-terminale primäre Amin übertragen wurde, um dies zu verhindern Gruppe daran hindern, Änderungen vorzunehmen.
Als nächstes ersetzen wir (mit Ala oder Ser) oder löschen die konservierten Reste am N-Terminus von nsp9, um zielspezifische Einschränkungen zu definieren.Basierend auf unseren MS-Daten, die zeigen, dass NiRAN ein nsp9-NMP-Addukt mit dem primären Amin des N-terminalen Rests von nsp9 bildet, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass die NMPylierung von nsp9 die virale Masterprotease (Mpro, nsp5) erfordert, um den N-terminalen Rest von nsp9 freizusetzen sein Polyprotein-Vorläufer.Um diese Hypothese zu testen, produzierten wir in E. coli ein Vorläuferprotein nsp7-11, das nsp9 enthielt, und führten einen Standard-NMPylierungstest in Gegenwart von [α-32P] UTP durch (Materialien und Methoden).Wie in Abbildung 5A (Spur 3) dargestellt, ist der ungeschnittene NSP7-11-Vorläufer nicht mit NSP12 radioaktiv markiert.Wenn dagegen nsp7-11 durch rekombinantes nsp5 gespalten wird, um nsp9 (und andere nsp9) aus dem Vorläufer freizusetzen, wird ein radioaktiv markiertes Protein nachgewiesen, das mit nsp9 wandert, was unsere Schlussfolgerung bestätigt, dass NiRAN und N-selektive Bildung kovalenter nsp9-NMP-Addukte vorliegen .Das terminale primäre Amin des N-terminalen Asn (Position 3825 in pp1a/pp1ab).Diese Schlussfolgerung wird auch durch Experimente mit dem nsp9-Konstrukt gestützt, das einen oder zwei zusätzliche Reste am N-Terminus enthält.In beiden Fällen wurde die NiRAN-vermittelte UMPylierung von nsp9 abgeschafft (SI-Anhang, Abbildung S7).Als nächstes produzierten wir ein Protein mit einem oder zwei Asn-Resten, die aus der 3825-NNEIMPK-3832-Peptidsequenz am N-Terminus von nsp9 entfernt wurden.In beiden Fällen wurde die UMPylierung von nsp9 vollständig blockiert (Abbildung 5B), was einen zusätzlichen Beweis dafür liefert, dass der echte N-Terminus von nsp9 als NMP-Rezeptor fungiert.
Die proteolytische Verarbeitung von nsp9 und die Rolle N-terminaler Reste bei der nsp12-vermittelten UMPylierung.(A) Die nsp9-UMPylierung erfordert einen freien nsp9-N-Terminus.Nsp7-11-His6 wird bei 30 °C in NMPylierungs-Nachweispuffer mit UTP in Gegenwart oder Abwesenheit von rekombinantem Mpro (nsp5-His6) vorinkubiert.Starten Sie nach 3 Stunden den NMPylierungstest, indem Sie nsp12-His6 hinzufügen, wie in Materialien und Methoden beschrieben.Als Kontrolle wurde die Reaktion verwendet, die nsp5-His6 (Spur 1) und nsp9-His6 (Spur 2) enthielt.Nach 10 Minuten wurde die Reaktion beendet und die Reaktionsmischung durch SDS-PAGE aufgetrennt.Das Protein wurde mit Coomassie Brilliant Blue (A, oben) gefärbt.Der Nsp7-11-His6-Vorläufer und das verarbeitete Produkt, das aus der Nsp5-His6-vermittelten Spaltung resultiert, sind rechts dargestellt.Bitte beachten Sie (aufgrund ihrer geringen Größe), dass nsp7 und nsp11-His6 in diesem Gel nicht nachweisbar sind und die Reaktion durch nsp5-His6 ergänzt wird (Spuren 1 und 4; die Position von nsp5-His6 ist durch einen ausgefüllten Kreis gekennzeichnet). oder nsp9-His6 (Spur 2) enthält eine kleine Menge MBP (angezeigt durch offene Kreise) als Restverunreinigungen, da sie als MBP-Fusionsproteine ausgedrückt werden (SI-Anhang, Tabelle S1).(B) Der Nsp9-His6-Variante fehlen ein oder zwei N-terminale Asn-Reste (Restnummerierung entsprechend der Position in pp1a/pp1ab) und sie wird gereinigt und mit nsp12-His6 und [α-32P] UTP inkubiert.B, SDS-PAGE mit Coomassie-Färbung ist oben abgebildet, B, das entsprechende Autoradiogramm ist unten abgebildet.Die Position des Molekulargewichtsmarkers (in Kilodalton) wird links angezeigt.(C) N-terminal konservierte Reste von HCoV-229E nsp9-His6 wurden durch Ala oder Ser ersetzt, und die gleiche Menge an Protein wurde in der nsp12-His6-vermittelten UMPylierungsreaktion verwendet.Die Reaktionsprodukte wurden durch SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie Brilliant Blue (C, oben) gefärbt, und radioaktiv markiertes nsp9-His6 wurde durch Phosphoreszenzbildgebung nachgewiesen (C, Mitte).Unter Verwendung von Wildtyp-Protein (wt) als Referenz (auf 100 % eingestellt) wurde die relative NMPylierungsaktivität (Mittelwert ± SEM) aus drei unabhängigen Experimenten berechnet.(D) Virustiter im p1-Zellkulturüberstand von Huh-7-Zellen, die mit HCoV-229E-Wildtyp-Huh-7-Zellen infiziert waren, und Mutanten, die bestimmte Aminosäuresubstitutionen in nsp9 trugen, wurden durch Plaque-Assay bestimmt.Als Negativkontrolle wurde die replikationsdefiziente RdRp-Motiv-C-Doppelmutante DD4823/4AA verwendet.
Der N-Terminus von nsp9 (insbesondere die Positionen 1, 2, 3 und 6) ist bei Mitgliedern der Orthocoronavirinae-Unterfamilie sehr konserviert (SI-Anhang, Abbildung S6).Um die mögliche Rolle dieser Reste bei der NSP12-vermittelten NSP9-NMPylierung zu untersuchen, wurden zwei aufeinanderfolgende Asn-Reste am N-Terminus von NSP9 durch Ala oder Ser (allein oder in Kombination) ersetzt.Im Vergleich zu Wildtyp-nsp9 führte der Ersatz von N3825 durch Ala oder Ser zu einer mehr als zweifachen Reduzierung der nsp12-vermittelten UMPylierung (Abbildung 5C).In Übereinstimmung mit unserer Schlussfolgerung, dass die NMPylierung am N-terminalen primären Amin und nicht an der Seitenkette des N-terminalen Rests erfolgt, beobachteten wir beim Austausch von N3825A und N3825S eine signifikante Rest-NMPylierung.Interessanterweise wird die nsp9-UMPylierung stärker reduziert (mehr als das Zehnfache), wenn das zweite Asn durch Ala oder Ser ersetzt wird, während der Ersatz von Ala an den Positionen 3, 4 und 6 nur einen mäßigen Einfluss auf die nsp9-UMPylierung hat (Abbildung 2). ).5C).Ähnliche Ergebnisse wurden mit ATP, CTP oder GTP erzielt (SI-Anhang, Abbildung S8).Zusammengenommen weisen diese Daten auf die Schlüsselrolle von N2826 (Position 2 in nsp9) bei der NMPylierung von nsp9 hin.
Um zusätzliche Beweise für die funktionelle Korrelation zwischen dem N-Terminus von nsp9 und der NMPylierung zu erhalten, führten wir ein Multiple Sequence Alignment (MSA) der nsp9-Sequenz der Coronavirus-Familie (variierend zwischen 104 und 113 Resten) durch (SI-Anhang, Abbildung). S6 ).Insgesamt wurde festgestellt, dass in 47 (bekannten und mutmaßlichen) Arten von 5 Gattungen der Orthocoronavirinae-Unterfamilie, die verschiedene Säugetiere, Vögel und Reptilienwirte infizieren, insgesamt nur 8 Reste invariant waren.Die umfangreichsten Veränderungen, einschließlich Deletionen und Insertionen, wurden in den Zyklen zwischen den Sekundärstrukturelementen von nsp9 beobachtet, wie durch frühere Strukturstudien festgestellt wurde (26–28).Im β-Strang und der α-Helix des C-terminalen Teils von nsp9 wurden fünf invariante Reste gefunden.Drei invariante Reste bilden das NNE-Motiv des N-Terminus von nsp9.Es zeigt sich, dass das zweite Asn dieses Motivs der einzige invariante Rest ist, der auch vom hypothetischen nsp9 des entfernt verwandten Frosch-Coronavirus geteilt wird und die Art Microhyla letovirus 1 in der Unterfamilie Letovirinae des Alphaletovirus darstellt.Die Konservierung von Resten in nsp9-Sekundärstrukturelementen kann durch strukturelle Überlegungen zur Aufrechterhaltung der Faltung oder bekannter RNA-Bindungseigenschaften erklärt werden.Diese Argumentation scheint jedoch nicht auf die Konservierung von NNE zuzutreffen, und vor dieser Studie war die Natur der Einschränkungen, die die Variation der Tripeptidsequenz begrenzen, völlig unklar.
Um die Bedeutung der nsp9-NMPylierung und der NNE-Konservierung bei der Coronavirus-Replikation zu bestimmen, haben wir HCoV-229E-Mutanten hergestellt, die einfache oder doppelte Substitutionen der N-terminalen Reste von nsp9 tragen, was darauf hinweist, dass die nsp9-NMPylierung in vitro schädlich ist.Bevor wir beginnen, versuchen wir die Frage zu beantworten, ob diese Substitutionen (in der Nähe der nsp8|9-Spaltungsstelle) die proteolytische Verarbeitung der C-terminalen pp1a-Region beeinflussen.Ein Satz von nsp7-11-Polyproteinkonstrukten, die entsprechende Substitutionen am N-Terminus von nsp9 enthielten, wurde in E. coli hergestellt und mit rekombinantem Mpro geschnitten.Die proteolytische Spaltung der vier Stellen (einschließlich der nsp9-flankierenden Stelle) wird durch eingeführte Substitutionen nicht wesentlich beeinflusst (SI-Anhang, Abbildung S9), mit Ausnahme struktureller Veränderungen in diesen Proteinen, die die Mpro-vermittelte nsp8|9-Spaltung (oder andere) stören. Webseite.
Huh-7-Zellen wurden mit genomlanger HCoV-229E-RNA transfiziert, die für Ala- oder Ser-Substitutionen in den konservierten NNE-Tripeptiden (N3825, N3826 und E3827) am nsp9-N-Terminus kodiert, was zeigt, dass die meisten Mutationen tödlich sind.Wir konnten das Virus retten, indem wir Ser oder Ala des N-terminalen Asn (N2835A oder N2835S) ersetzten, konnten das Virus jedoch nicht durch andere Einzel- und Doppelmutationen in der NNE-Sequenz (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Abbildung 5D).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Replikation von Coronaviren in Gewebekulturen eingeschränkt ist (gleich oder ähnlich), was die natürliche Mutation von nsp9-NMPylierungsstellen im Körper einschränkt und die Schlüsselrolle dieser Reaktion im Lebenszyklus von Coronaviren unterstützt.
In der letzten Reihe von Experimenten produzierten wir C-terminal His6-markiertes SARS-CoV-2 nsp12 und nsp9 sowie zwei mutierte Formen von nsp12 in E. coli.Die Reste des aktiven Zentrums in den NiRAN- und RdRp-Domänen wurden stattdessen durch Ala ersetzt (Abbildung 6A und SI-Anhang, Tabelle S2).K4465 in SARS-CoV-2 nsp12 entspricht K4135 in HCoV-229E (SI-Anhang, Abbildung S2), was sich als erforderlich für die NiRAN-Aktivität und die HCoV-229E-Replikation erwies (Abbildung 3D und E).Dieser Rest entspricht auch dem arteriellen Virus-EAV-nsp9-K94-Rest, von dem zuvor gezeigt wurde, dass er für die NiRAN-Selbst-UMPylierung/Selbst-GMPylierung notwendig ist (16).Wie in Abbildung 6B gezeigt, weist SARS-CoV-2 nsp12 UMP-Transferase-Aktivität unter Verwendung von nsp9 als Substrat auf, während die Mutante des aktiven Zentrums nsp12_K4465A inaktiv ist.Die doppelte Substitution in der SDD-charakteristischen Sequenz des RdRp-Motivs C hat keinen Einfluss auf die UMP-Transferase-Aktivität (Abbildung 6B), was darauf hinweist, dass die RdRp-Aktivität keinen direkten Einfluss auf die nsp9-UMPylierung hat.Ähnliche Daten wurden mit CTP, GTP und ATP erhalten (SI-Anhang, Abbildung S10).Zusammenfassend deuten diese Daten darauf hin, dass die NiRAN-vermittelte nsp9-NMPylierung eine konservative Aktivität bei Coronaviren aufweist, die verschiedene Gattungen der Orthocoronavirus-Unterfamilie repräsentieren.
SARS-CoV-2 nsp12-vermittelte NMPylierung von nsp9.(A) Coomassie-gefärbtes SDS-Polyacrylamid-Gel, das das im NMPylierungstest verwendete rekombinante Protein zeigt.Als Kontrolle wurde ein mutiertes Protein mit Substitution des aktiven Zentrums in der NiRAN-Domäne (K4465A) und der RdRp-Domäne (DD5152/3AA) von SARS-CoV-2 nsp12 verwendet.Die Nummerierung der Reste basiert auf der Position in pp1ab.(B) Autoradiogramm des UMPylierungsnachweises unter Verwendung von nsp9-His6 und [α-32P]UTP als Substrat von nsp12-His6 (Wildtyp [wt] und Mutante).Die Molekülmasse (in Kilodalton) des markierten Proteins ist links dargestellt.
NiRAN-Domänen sind im Allgemeinen in Nidovirales konserviert (16), was darauf hindeutet, dass sie enzymatische Reaktionen katalysieren, die für die Nidovirus-Replikation wesentlich sind.In dieser Studie konnten wir nachweisen, dass die NiRAN-Domäne des Coronavirus NMP (aus NTP erzeugt) auf nsp9 überträgt, ein mysteriöses RNA-Bindungsprotein, das an der Virusreplikation beteiligt ist (26 ?? 29 ), um es als natürliches Ziel zu bestimmen und Partner von Coronavirus RTC.
Die NiRAN-Domäne teilt drei Sequenzmotive (AN, BN und CN), die eine sehr kleine Anzahl von Resten enthalten, die in allen Familien in der monophyletischen, aber hoch differenzierten Nidovirales-Reihenfolge konserviert sind (8, 16).Neuere Studien haben gezeigt, dass sie strukturell mit einer weitgehend uncharakterisierten Familie von Proteinkinase-ähnlichen Proteinen verwandt sind, die ursprünglich als SelO-Familie bezeichnet wurden (17, 19, 22, 30, 31).SelO-verwandte Proteine weisen Kinasefalten auf, es fehlen jedoch mehrere konservierte Reste des aktiven Zentrums in klassischen Kinasen (22, 32).Basierend auf der umgekehrten Ausrichtung der an das aktive Zentrum gebundenen und durch spezifische Wechselwirkungen stabilisierten ATP-Moleküle wurde die Hypothese aufgestellt und anschließend bestätigt, dass SelO AMP (anstelle von Phosphat) auf das Proteinsubstrat überträgt (22), während ein anderes bakterielles SelO-ähnliches Protein YdiU dies tut Kürzlich wurde gezeigt, dass es die kovalente Bindung von UMP an Tyr- und His-Reste verschiedener Proteinsubstrate katalysiert (33).
Um die Vorhersage der mutmaßlichen Reste des aktiven Zentrums der NiRAN-Domäne des Coronavirus zu bestätigen und zu erweitern, verwendeten wir biochemische und umgekehrte genetische Methoden, um eine Mutationsanalyse am Coronavirus nsp12 (Abbildung 3D und E- und SI-Anhang, Abbildung S3 und Tabelle) S1â durchzuführen S4).Die Daten zeigen, dass der Ersatz von HCoV-229E K4135, R4178 und D4280 durch Ala die In-vitro-NMP-Transferaseaktivität und die Virusreplikation in der Zellkultur eliminiert (Abbildung 3D und E- und SI-Anhänge, Abbildung S3), was ihr Vorhandensein in NTP-γ-Phosphat unterstützt (K4135, R4178) und die Koordination der Metallionen im aktiven Zentrum (D4280).Die E4145A-Substitution des konservierten Glu im Bereich des Vogelnestvirus, von der vorhergesagt wurde, dass sie die Position K4135 (17) stabilisiert, eliminiert nachweislich die Virusreplikation, überraschenderweise blieb die Aktivität jedoch im In-vitro-NMPylierungstest erhalten (Abbildung 3D und E und). SI-Anhang, Abbildung S3 und Tabellen S1–S4).Eine ähnliche Beobachtung wurde gemacht, als die entsprechende Substitution im YdiU-Homolog von Salmonella typhimurium (E130A) eingeführt wurde (33).Zusammengenommen unterstützen diese Daten eher die regulatorische Funktion dieses konservierten Rests als die katalytische Funktion.
Das Ersetzen des konservierten Phe-Rests (F4281A) innerhalb des Nestovirus-Bereichs in der HCoV-229E-NiRAN-Domäne (8) führte zu einer Verringerung der NMPylierungsaktivität in vitro und einer signifikanten Verringerung der Virusreplikation in der Zellkultur (Abbildung 3D, E und SI). Anhang, Abbildung S3).Die Daten stimmen mit der wichtigen regulatorischen Funktion dieses Rests überein, wie beispielsweise dem zuvor gezeigten homologen DFG-Motiv-Phe-Rest.In klassischen Proteinkinasen ist es Teil der Mg2+-Bindungsschleife und hilft beim Aufbau und der Regulierung der Wirbelsäule.??Erforderlich für eine effektive katalytische Aktivität (32, 34).Der Ersatz von K4116-Resten durch Ala und Arg (im preAN-Motiv) eliminierte die Virusreplikation und hatte erwartungsgemäß unterschiedliche Auswirkungen auf die NMP-Transferase-Aktivität in vitro, abhängig von der eingeführten Aminosäureseitenkette (Abbildung 3D und E- und SI-Anhänge). , Abbildung S3).Die funktionellen Daten stimmen mit den Strukturinformationen überein, was darauf hinweist, dass dieser Rest eine Wechselwirkung mit ATP-Phosphat aufgebaut hat (17).In der NiRAN-Domäne anderer verschachtelter Virusfamilien ist die Position von HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 durch Lys, Arg oder His (8) besetzt, was darauf hinweist, dass die funktionelle Einschränkung dieses spezifischen Rests gelockert wurde.Durch den Austausch von D4188A und D4283A wird die Enzymaktivität eliminiert oder stark reduziert und die Virusreplikation verhindert (Abbildung 3).Diese beiden Reste sind in den meisten (aber nicht allen) verschachtelten Viren konserviert (8), was auf eine wichtige familienspezifische, aber möglicherweise nicht katalytische Funktion hinweist.Als Kontrollen wurden Ala-Substitutionen mehrerer anderer Lys- und Asp-Reste (K4113A, D4180A, D4197A und D4273A) verwendet, die in den Coronaviridae- oder anderen Nestioviridae-Familien (8) nicht konserviert sind.Wie erwartet sind diese Substitutionen weitgehend tolerierbar, wobei es in einigen Fällen zu einem leichten Rückgang der Enzymaktivität und der Virusreplikation kommt (Abbildung 3 und SI-Anhang, Abbildung S3).Insgesamt stimmen die Daten zur Coronavirus-Mutagenese sehr gut mit den Self-GMP- und Reverse-Genetik-Daten von EAV NiRAN-RdRp (16) überein, in dem der EAV nsp9 (Coronavirus nsp12-Ortholog) Rest K94 (entsprechend HCoV-229E K4135) wichtige Funktionen erfüllt. R124 (entspricht R4178), D132 (entspricht D4188), D165 (entspricht D4280), F166 (entspricht F4281).Darüber hinaus stimmen die HCoV-229E-Mutagenesedaten mit den zuvor gemeldeten SARS-CoV-Reverse-Genetik-Daten überein und erweitern diese (16) und ähneln denen, die für die entsprechende CN-Motiv-Phe-to-Ala-Mutante SARS-CoV_nsp12 beobachtet wurden beschriebener Phänotyp -F219A und HCoV-229E_F4281A (Abbildung 3 D und E und SI-Anhang, Abbildung S3 und Tabelle S1-S4).
Im Vergleich zu EAV-Orthologen (16), die eine klare Präferenz für UTP und GTP (in der Selbst-NMPylierungsreaktion) haben, zeigt unsere Studie, dass die NiRAN-Domäne des Coronavirus (dargestellt durch HCoV-229E und SARS-CoV-2) effektiv sein kann Übertragen Alle vier NMPs, obwohl UMP leicht bevorzugt wird (Abbildungen 1 und 3).Die relativ geringe Spezifität des spezifischen NTP-Cosubstrats steht im Einklang mit der kürzlich berichteten Superkompositstruktur SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13, in der ADP-Mg2+ an das aktive Zentrum von NiRAN bindet, jedoch nicht an den Adeninteil der Ausbildung spezifischer Wechselwirkungen (17).In unserer Studie hat der in der NMPylierungsreaktion verwendete Nukleotidtyp keinen unterschiedlichen Einfluss auf die Aktivität des mutierten Proteins (SI-Anhang, Abbildung S3), was darauf hinweist, dass keiner dieser Reste eng mit der Bindung einer bestimmten Nukleobase zusammenhängt.Die strukturelle Basis und mögliche biologische Bedeutung der unterschiedlichen NTP-Cosubstratpräferenzen, die in den NiRAN-Domänen von Coronaviren und arteriellen Viren beobachtet werden, müssen noch untersucht werden;Sie können wahr sein oder auf die Einschränkungen ihrer jeweiligen Studien zurückzuführen sein.Derzeit kann nicht ausgeschlossen werden, dass die potenzielle NMPylator-Aktivität der NiRAN-Domäne des arteriellen Virus (im Vergleich zur zuvor charakterisierten Selbst-NMPylierungsaktivität) eine andere Co-Substrat-Präferenz aufweist, wenn man die Ähnlichkeit zwischen dem arteriellen und dem Coronavirus berücksichtigt Die NiRAN-Domäne ist an ihrer Grenze.Sequenzbasierter Vergleich (16).Im Vergleich zur Pseudokinase SelO, die Mg2+ als Cofaktor verwendet, ist die Aktivität des Coronavirus und des arteriellen Virus NiRAN von Mn2+ abhängig (16) (Abbildung 3C und SI-Anhang, Abbildung S1).Die Mn2+-Abhängigkeit und offensichtliche Bevorzugung von UTP ist ein ungewöhnliches Merkmal von Protein-NMPylatoren und wurde erst kürzlich im YdiU-Protein von Salmonella typhimurium bestätigt, das die streng Mn2+-abhängige Protein-Chaperon-UMPylierung katalysiert, um Zellen vor Stressinduktion zu schützen Zell-ATP-Pool ( 33).
Die kürzlich beschriebene strukturelle Ähnlichkeit zwischen der NiRAN-Domäne des Coronavirus und zellulären Proteinkinasen (17, 19) liefert zusätzliche Unterstützung für die Fähigkeit von NiRAN, NMP kovalent mit anderen Proteinen zu verknüpfen, über die wir in dieser Studie berichtet haben.Wir haben unsere Suche nach möglichen NiRAN-Zielen auf die von HCoV-229E ORF1a kodierten Proteine konzentriert, von denen bekannt ist, dass sie direkt oder indirekt die ORF1b-kodierte Replikase von RTC unterstützen (12, 35).Unsere Experimente liefern schlüssige Beweise für die effektive und spezifische NMPylierung von nsp9 (Abbildung 2).Wenn das Zielprotein in einem 8- bis 10-fach höheren molaren Überschuss als das Enzym (nsp12) verwendet wird, wird bestätigt, dass nsp9 vollständig (mono)NMPisiert ist (Abbildung 4).Wir kamen zu dem Schluss, dass die Wechselwirkung zwischen nsp12 und nsp9 nur von kurzer Dauer ist und keinen stabilen Komplex mit nsp9 bildet (in Abwesenheit anderer RTC-Untereinheiten).Diese Schlussfolgerung wird durch Proteininteraktionsstudien am SARS-CoV-Proteom gestützt (35).Die MS-Analyse identifizierte das primäre Amin des N-terminalen Rests von nsp9 als NMPylierungsstelle (SI-Anhang, Abbildung S5).Die Bildung der Phosphoramidatbindung und der N-terminalen Aminogruppe unterscheidet die NiRAN-vermittelte NMPylierungsaktivität von der SelO-vermittelten AMPylierungsreaktion von Pseudomonas syringae, die die Bildung von O-verknüpftem AMP an Ser-, Thr- oder Tyr-Resten katalysiert. Peptidaddukt ( 22) und S. typhimurium YdiU bildet O-verknüpfte (mit Tyr) und N-verknüpfte (mit His) Peptid-UMP-Addukte.Die begrenzten Informationen, die über die SelO-Proteinfamilie verfügbar sind, deuten darauf hin, dass sich Mitglieder dieser großen Proteinfamilie in der Bildung von Peptid-NMP-Addukten stark unterscheiden.Dies ist eine interessante Beobachtung, die weitere Untersuchungen verdient.
Die in dieser Studie gewonnenen Daten führten uns zu der Hypothese, dass die NMPylierung von nsp9 einen freien N-Terminus erfordert.Im Zusammenhang mit der Virusreplikation wird dies durch die durch Mpro und pp1ab vermittelte proteolytische Spaltung der nsp8|nsp9-Verarbeitungsstelle im Replikase-Polyprotein pp1a erreicht.Bei den meisten Coronaviren besteht der Unterschied zwischen dieser spezifischen Stelle (VKLQ|NNEI in HCoV-229E) und allen anderen Mpro-Spaltstellen des Coronavirus darin, dass Asn (und nicht ein anderer kleiner Rest wie Ala, Ser oder Gly) P1â???Standort (36).Die in den frühen Studien erhaltenen Peptidspaltungsdaten zeigten, dass die Spaltungseffizienz der nsp8|nsp9-Stelle geringer war als die anderer Stellen, was darauf hindeutet, dass 1) diese spezifische Stelle möglicherweise eine regulatorische Rolle bei der rechtzeitigen koordinierten Verarbeitung des C-Terminus spielt pp1a-Region oder 2) a Die Rolle des speziell konservierten nsp9-N-Terminus bei der Virusreplikation (37).Unsere Daten (Abbildung 5A) zeigten, dass die rekombinante Form von nsp9, die die echte N-terminale Sequenz trägt, durch nsp12 effektiv NMPisiert wurde.Die N-terminale flankierende Sequenz wurde durch Faktor Xa (nsp9-His6; SI-Anhang, Tabelle S1) oder Mpro-vermittelte Spaltung (nsp7-11-His6; Abbildung 5A und SI-Anhang, Tabelle S1) entfernt.Wichtig ist, dass der ungeschnittene nsp9-haltige Vorläufer nsp7-11-His6 Resistenz gegen die NMPylierung von nsp12 zeigte, was mit unseren Daten übereinstimmt und darauf hinweist, dass das nsp9-NMP-Addukt über das N-terminale primäre Amin gebildet wird (SI-Anhang, Abbildung S5). .Um ein tieferes Verständnis der NiRAN-Substratspezifität zu erlangen, konzentrierten wir uns anschließend auf die benachbarten N-terminalen Reste von nsp9.In Abwesenheit anderer Proteine sind sie strukturell flexibel und können daher nicht in der unmarkierten Form von nsp9 nachgewiesen werden (26 28, 38), was auf ihre begrenzte natürliche Variation hinweist. Dies ist auf die wichtige sequenzspezifische (nicht sekundärstrukturbezogene) Proteinstruktur zurückzuführen. Funktion des N-terminalen Fragments von nsp9.Ala-Substitutionen konservierter Reste in dieser Region (Abbildungen 5C und D sowie SI-Anhang, Abbildung S8) zeigen, dass N3826 für die NSP9-NMPylierung in vitro essentiell ist, während N3825A- und E3827A-Substitutionen zu einer Verringerung der NMPylierung führen, während M3829A- und P3830A-Substitutionen dies nicht tun .Beeinflusst offensichtlich die NMPylierung von nsp9.Obwohl die Substitution von N-terminalem Asn (N3825A, N3825S) nur einen mäßigen Einfluss auf die NSP9-NMPylierung und Virusreplikation in der Zellkultur hat (Abbildung 5C und D), ist die Deletion einer Asn-Restsequenz aus dem N-terminalen 3825-NN-Dipeptid erwies sich als tödlich für Viren, was darauf hindeutet, dass ein Asn-Rest vor einem anderen Rest am N-Terminus, vorzugsweise Asn, erforderlich ist, obwohl es scheint, dass die Substitution ähnlicher Reste teilweise toleriert werden kann (Abbildung 5B, C und D).Wir kommen zu dem Schluss, dass das 3825-NN-Dipeptid, insbesondere der konservierte und essentielle N3826-Rest im Coronavirus-Bereich (SI-Anhang, Abbildung S6), die korrekte Bindung und Ausrichtung des nsp9-N-Terminus im aktiven Zentrum von NiRAN gewährleistet.
Durch Ersetzen des konservierten Glu aller Unterfamilien durch Ala (E3827A) bleibt die nsp9-NMPylierung in vitro erhalten, ist jedoch für Viren in der Zellkultur tödlich (Abbildung 5C und D), was auf die zusätzliche Funktion dieses Rests hinweist, beispielsweise bei Schlüsselinteraktionen (NMPyliert oder unmodifiziert). ) nsp9 N-Terminus und andere Faktoren, die an der Virusreplikation beteiligt sind.Nsp9-Mutationen hatten keinen Einfluss auf den proteolytischen Prozess von nsp9 oder benachbarten nsps (39) (SI-Anhang, Abbildung S9), was darauf hinweist, dass die tödlichen Phänotypen mehrerer beobachteter nsp9-Mutationen nicht durch die Fehlregulation des C-proteolytischen Prozesses-terminalen pp1a-Bereichs verursacht wurden .
Die obigen Daten liefern Hinweise darauf, dass nach Mpro-vermittelter Behandlung der nsp8|9-Spaltungsstelle in pp1a/pp1ab der N-Terminus von nsp9 UMPyliert (oder teilweise mit einem anderen NMP modifiziert) werden kann.Darüber hinaus führten die hervorragende Konservierung des N-Terminus von nsp9 (einschließlich der singulären und invarianten Asn-Reste in der Coronavirus-Familie) und die in dieser Studie erhaltenen Daten zur umgekehrten Genetik (Abbildungen 3E und 5D) zu dem Schluss, dass die beschriebene NMPylierung von nsp9 vorliegt ist biologisch verwandt und für die Replikation des Coronavirus essentiell.Die funktionellen Konsequenzen dieser Modifikation müssen noch untersucht werden, beispielsweise im Hinblick auf die zuvor beschriebene (unspezifische) RNA-Bindungsaktivität von nsp9 (unmodifizierte Form) (2628).Die N-terminale NMPylierung kann auch die Wechselwirkung von nsp9 mit Protein- oder RNA-Substraten oder die Bildung verschiedener vierstufiger Anordnungen beeinflussen.Diese wurden in Strukturstudien beobachtet und es wurde bestätigt, dass sie funktionell mit der Coronavirus-Replikation zusammenhängen, insbesondere wenn diese Modifikation fehlt (26-29, 40).
Obwohl die Zielspezifität der NiRAN-Domäne des Coronavirus noch detaillierter charakterisiert werden muss, zeigen unsere Daten, dass die Proteinzielspezifität der NiRAN-Domäne des Coronavirus sehr eng ist.Obwohl die Konservierung wichtiger Reste des aktiven Zentrums (8, 16) in der NiRAN-Domäne aller Nidovirus-Familien die Aktivität des konservierten NMPylators dieser Proteine stark unterstützt, muss die Identität der Substratbindungstaschenreste dieser Domäne noch charakterisiert werden , und kann zwischen verschiedenen Familien von Nidovirales unterschiedlich sein.Ebenso müssen die relevanten Ziele anderer verschachtelter Viren noch ermittelt werden.Sie können entfernte Orthologe von nsp9 oder anderen Proteinen sein, da die Sequenzen außerhalb der fünf Replikasedomänen, die im Allgemeinen in verschachtelten Viren konserviert sind, weniger konserviert sind (8), einschließlich des Genomarrays zwischen Mpro und NiRAN. Unter ihnen befindet sich nsp9 im Coronavirus.
Darüber hinaus können wir derzeit nicht ausschließen, dass die NiRAN-Domäne zusätzliche (einschließlich zelluläre) Ziele hat.In diesem Fall ist es erwähnenswert, dass die bakteriellen Homologen in diesem neu entstehenden Protein NMPylatoren (NMPylatoren) (30, 31) „Meisterregulatoren“ zu haben scheinen?NMP moduliert eine Vielzahl zellulärer Proteine, um deren Downstream-Aktivitäten zu regulieren oder zu eliminieren, und spielt dadurch eine Rolle bei einer Vielzahl biologischer Prozesse, wie z. B. der zellulären Stressreaktion und der Redoxhomöostase (22, 33).
In dieser Studie (Abbildungen 2 und 4 und SI-Anhang, Abbildungen S3 und S5) konnten wir nachweisen, dass nsp12 den UMP (NMP)-Teil an eine einzelne (konservierte) Position in nsp9 übertrug, während andere Proteine darin nicht verändert wurden Unter den gegebenen Bedingungen wird eine wohldefinierte (statt einer losen) Substratspezifität unterstützt.Dementsprechend ist die NMPylierungsaktivität von nsp12 im Vergleich zur N-terminalen nsp9-NMPylierung sehr gering, sein Nachweis erfordert eine längere Autoradiographie-Belichtungszeit und es wird eine 10-fache Erhöhung der nsp12-Konzentration verwendet.Darüber hinaus konnte unsere MS-Analyse keine Hinweise auf eine NMPylierung von nsp12 liefern, was darauf hindeutet, dass die Selbst-NMPylierung der NiRAN-Domäne (bestenfalls) eine sekundäre Aktivität ist.Es sollte jedoch beachtet werden, dass andere Studien vorläufige Beweise dafür geliefert haben, dass der Selbst-AMPylierungsstatus von bakteriellen NMPylatoren ihre NMPylierungsaktivität auf anderen Proteinsubstraten steuern kann (22, 33).Daher ist weitere Forschung erforderlich, um die möglichen funktionellen Auswirkungen von Selbst-NMPylierungsaktivitäten zu untersuchen, die für EAV nsp9 (16) und Coronavirus nsp12 (diese Studie) berichtet wurden, einschließlich des vorgeschlagenen Chaperon-ähnlichen Effekts auf die Faltung der C-terminalen RdRp-Domäne ( 16) ).
Zuvor wurden mehrere Hypothesen bezüglich der möglichen Downstream-Funktionen der nidoviralen NiRAN-Domäne in Betracht gezogen, darunter RNA-Ligase, RNA-capped Guanylattransferase und Protein-Priming-Aktivität (16), aber keine davon ist mit den verfügbaren Downstream-Funktionen kompatibel.Die in den folgenden Positionen erhaltenen Informationen sind genau die gleichen, ohne dass zusätzliche Annahmen getroffen werden.Die in dieser Studie erhaltenen Daten stimmen am besten damit überein (können jedoch nicht beweisen), dass die NiRAN-Domäne an der Initiierung der proteininduzierten RNA-Synthese beteiligt ist.Bisher wurde angenommen, dass die Funktion der NiRAN-Domäne in 5??²-RNA-Capping- oder RNA-Ligationsreaktionen werden von diesen und der Unterstützung anderer Daten nicht beeinflusst.Daher geht man beispielsweise davon aus, dass das aktive Zentrum von NiRAN das konservierte Asp als allgemeine Base umfasst (D252 in Pseudomonas syringae SelO; D4271 in HCoV-229E pp1ab; D208 in SARS-CoV-2 nsp12) (SI-Anhang, Abbildung 2). ).S2) (17, 22, 33), während die Katalyse in der ATP-abhängigen RNA-Ligase und dem RNA-Capping-Enzym durch das kovalente Enzym (Lysyl-N)-NMP-Zwischenprodukt erfolgt, an dem ein nicht veränderter Lys-Rest beteiligt ist ( 41).Darüber hinaus stehen die bemerkenswerte sequenzbasierte Spezifität des Coronavirus-NiRAN für konservierte Proteinziele und die entspannte Spezifität für NTP-Cosubstrate (bevorzugt UTP) NiRAN-vermittelten Capping-Enzym- oder RNA-Ligase-ähnlichen Funktionen entgegen.
Offensichtlich ist noch viel zusätzliche Arbeit erforderlich, um die mögliche Rolle von nsp9-UMP (nsp9-NMP) bei der proteininduzierten RNA-Synthese zu verifizieren und, falls bewiesen, näher zu erläutern, was mehrere interessante, aber (bisher) zuvor veröffentlichte Berichte miteinander verbinden wird .Einzelbeobachtungen.Beispielsweise wurde festgestellt, dass das Ende der Negativstrang-RNA des Coronavirus mit einem Oligo(U)-Strang beginnt (42, 43).Diese Beobachtung steht im Einklang mit der Vorstellung, dass die Synthese von Negativstrang-RNA durch die Bindung der UMPylierten Form von nsp9 an den Poly(A)-Schwanz (Trigger) initiiert wird, was durch seine RNA-Bindungsaktivität und/oder Interaktion mit gefördert werden kann ein weiteres RTC-Protein.Der von nsp9 bereitgestellte UMP-Anteil kann dann als „Primer“ für die nsp7/8/nsp12-vermittelte Oligouridylierung verwendet werden, wobei der 3??²-Poly(A)-Schwanz in der genomischen RNA oder einer anderen Oligo(A)-enthaltenden Sequenz verwendet wird dient als Matrize, ähnlich dem Mechanismus, der für das Picornavirus-VPg-Protein etabliert wurde (44).Was ist, wenn der Vorschlag „nicht normativ“ ist????Der Beginn der (proteininduzierten) Negativstrang-RNA-Synthese stellt eine Verbindung zu den Beobachtungen her, die darauf hinweisen, dass die Coronavirus-Negativstrang-RNA an ihrem Ende UMP (anstelle von UTP) aufweist (42), was als Hinweis darauf angesehen wird, dass die Nukleinsäure Dicer spaltet das Ende phosphoryliert durch eine unbekannte Uridin-spezifische Endonuklease.Wenn dies bestätigt wird, kann diese hydrolytische Aktivität der Nukleinsäure dazu beitragen, die oligomere UMPylierte Form von nsp9 vom 5²-Ende des entstehenden negativen Strangs freizusetzen.Die mögliche Rolle von nsp9 beim Protein-Priming steht auch im Einklang mit früheren Reverse-Genetik-Studien, die gezeigt haben, dass nsp9 (und nsp8) kritisch und spezifisch mit dem konservierten cis-wirkenden RNA-Element nahe dem 3-Ende des Coronavirus-Genoms interagieren.45).Dem Bericht zufolge können diese bisherigen Beobachtungen nun erneut überprüft und durch weitere Forschung erweitert werden.
Zusammenfassend haben unsere Daten die spezifische Aktivität eines proprietären verschachtelten Virus-Enzym-Tags bestimmt, der am N-Terminus mit RdRp verknüpft ist.Beim Coronavirus wird diese neu entdeckte NiRAN-vermittelte UMPylator/NMPylator-Aktivität genutzt, um auf Mn2+ und benachbarte Asn-Reste zurückzugreifen und die Bildung von (niederenergetischen) Phosphoramidatbindungen mit dem N-terminalen primären Amin zu bewirken.Durch Mpro-vermittelte Spaltung an der nsp8|9-Spaltstelle kann das nsp9-Ziel für die NMPylierung verwendet werden, was auf die funktionelle Kopplung zwischen der Protease und der NiRAN-Domäne hinweist, die sich bis zu RdRp erstreckt.Die Konservierung wichtiger Reste im aktiven Zentrum von nsp12 NiRAN und im nsp9-Ziel liefert in Kombination mit Daten von zwei Coronaviren, darunter SARS-CoV-2, starke Beweise dafür, dass es sich bei der NMPylierung von nsp9 um ein Coronavirus handelt. Konservative Merkmale sind auch ein wichtiger Schritt bei der Virusreplikation.Die verfügbaren Daten lassen uns zu dem Schluss kommen, dass die spezifische Rolle der NMPylierten Form von nsp9 bei der proteininduzierten RNA-Synthese ein vernünftiges Szenario für das Coronavirus und andere verschachtelte Viren darstellt und dass NiRAN möglicherweise auch auf andere nicht identifizierte Proteine abzielt.Regulieren Sie den Virus.Interaktion mit dem Gastgeber.Sollte sich dies bestätigen, wird die Beteiligung von Proteinprimern an der viralen RNA-Synthese die Sequenzaffinität der Mpro/3CLpro- und RdRp-Domänen zwischen dem zuvor entdeckten Coronavirus und der Picornavirus-ähnlichen Supergruppe (9) erhöhen, die nun in den kürzlich etablierten Pisonivirites vereint wurden ( 46) in der Kategorie.
Unsere Daten zeigen auch, dass die in dieser Studie identifizierten grundlegenden, selektiven und konservativen Enzymaktivitäten als Ziele für antivirale Medikamente verwendet werden können.Verbindungen, die die Bindung (und anschließende Modifikation) des konservierten nsp9-N-Terminus im aktiven Zentrum von NiRAN stören, können zu wirksamen und vielseitigen antiviralen Medikamenten entwickelt werden, die für die Behandlung tierischer und menschlicher Coronaviren aus verschiedenen (Unter-)Genus-Infektionen geeignet sind , einschließlich SARS-CoV-2 und Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus.
Die kodierende Sequenz des in dieser Studie produzierten Coronavirus-Proteins wurde durch RT-PCR unter Verwendung von RNA amplifiziert, die aus mit HCoV-229E infiziertem Huh-7 oder mit SARS-CoV-2 infiziertem Vero E6 isoliert wurde, und mithilfe von Standardklonierungsverfahren eingefügt.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) oder pASK3-Ub-CHis6 (47) Expressionsvektor (SI-Anhang, Tabellen S1 und S2).Einzelne Codon-Substitutionen wurden durch PCR-basierte ortsgerichtete Mutagenese eingeführt (48).Um das MBP-Fusionsprotein herzustellen, wurden E. coli-TB1-Zellen mit dem entsprechenden pMAL-c2-Plasmidkonstrukt transformiert (SI-Anhang, Tabelle S1).Das Fusionsprotein wurde durch Amylose-Affinitätschromatographie gereinigt und mit Faktor Xa gespalten.Anschließend wurde das C-terminale His6-markierte Protein durch Ni-immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (Ni-IMAC) wie zuvor beschrieben gereinigt (49).Zur Herstellung des Ubiquitin-Fusionsproteins verwendeten E. coli-TB1-Zellen das entsprechende pASK3-Ub-CHis6-Plasmidkonstrukt (SI-Anhang, Tabellen S1 und S2) und pCGI-Plasmid-DNA, die für Ubiquitin-spezifische C-terminale Hydrolase 1 (Ubp1) kodiert.Verwandlung (47).Das C-terminale His6-markierte Coronavirus-Protein wurde wie zuvor beschrieben gereinigt (50).
Der Selbst-NMPylierungstest von HCoV-229E nsp12-His6 wurde wie in EAV nsp9 (16) beschrieben durchgeführt.Kurz gesagt, nsp12-His6 (0,5 µM) enthält 50 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM Dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM Puffer, inkubiert das angegebene NTP und 0,17 µM entsprachen [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) bei 30 °C für 30 Minuten.In allen anderen (Standard-)NMPylierungstests der nsp12-vermittelten nsp9-NMPylierung werden die Reaktionsbedingungen wie folgt angepasst: nsp12-His6 (0,05 µM) und nsp9-His6 (4 µM) in Gegenwart von 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM angezeigtes NTP und 0,17 µM passendes [α32-P]NTP.Nach 10-minütiger Inkubation bei 30 °C wurde die Reaktionsprobe mit SDS-PAGE-Probenpuffer gemischt: 62,5 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5 % SDS, 10 % Glycerin und 0,005 % Bromphenol Blau.Das Protein wurde durch 5-minütiges Erhitzen auf 90 °C denaturiert und durch 12 % SDS-PAGE aufgetrennt.Das Gel wird fixiert und mit Coomassie Brilliant Blue-Lösung (40 % Methanol, 10 % Essigsäure, 0,05 % Coomassie Brilliant Blue R-250) gefärbt, entfärbt und 20 Stunden lang einem phosphoreszierenden Bildschirm ausgesetzt (um NSP12 aus der NMPylierung zu erkennen). oder (maximal) 2 Stunden (zur Beurteilung der NSP9-NMPylierung).Zum Scannen des Bildschirms wurde ein Typhoon 9200-Imager (GE Healthcare) verwendet, und ImageJ wurde zur Analyse der Signalintensität verwendet.
Für die MS-Analyse wurden 1 µM nsp12-His6 und 10 µM nsp9 (ohne Hexahistidin-Tag) in der NMPylierungsanalyse (SI-Anhang, Tabelle S1) sowie die erhöhte Konzentration von 500 µM UTP und GTP verwendet.Je nach Konzentration und erwarteter Proteinqualität wurde ein Waters ACQUITY H-Class HPLC-System mit einer MassPrep-Säule (Waters) verwendet, um 1 bis 10 µL gepufferter Proteinlösungen online zu entsalzen.Das entsalzte Protein wird durch den folgenden Gradienten von Puffer A (Wasser/0,05 % Ameisensäure) und Puffer B (Acetonitril/0,045 % Ameisensäure) in die Elektrospray-Ionenquelle des Synapt G2Si-Massenspektrometers (Waters) eluiert, und die Säulentemperatur beträgt 60 °C und eine Flussrate von 0,1 ml/min: isokratische Elution mit 5 % A für 2 Minuten, dann ein linearer Gradient bis 95 % B innerhalb von 8 Minuten und Aufrechterhaltung von 95 % B für weitere 4 Minuten.
Es werden positive Ionen mit einem Massenbereich von 500 bis 5000 m/z erfasst.Zur automatischen Massendriftkorrektur wird alle 45 Sekunden Glu-Fibrinopeptid B gemessen.Verwenden Sie die MassLynx-Instrumentensoftware mit MaxEnt1-Erweiterung, um das Durchschnittsspektrum nach Abzug der Basislinie und Glättung zu entfalten.
UMPyliertes HCoV-229E nsp9 wurde durch Zugabe von modifiziertem Trypsin in Sequenzierungsqualität (Serva) verdaut und über Nacht bei 37 °C inkubiert.Zum Entsalzen und Konzentrieren der Peptide wurde eine Chromabond C18WP-Spinsäule (Teilenummer 730522; Macherey-Nagel) verwendet.Abschließend wurde das Peptid in 25 µL Wasser gelöst, das 5 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure enthielt.
Die Proben wurden mittels MS mit einem Orbitrap Velos Pro-Massenspektrometer (Thermo Scientific) analysiert.Das ultimative Nano-HPLC-System (Dionex), ausgestattet mit einem maßgeschneiderten, am Ende montierten 50 cm??75 μm C18 RP-Säule, gefüllt mit 2,4 μm großen Magnetkügelchen (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH). Online-Verbindung zum Massenspektrometer über die Proxeon-Nanospray-Quelle;Injizieren Sie 6 µL Trypsin-Verdauungslösung in einen Innendurchmesser von 300 µm ×??1 cm C18 PepMap-Vorkonzentrationssäule (Thermo Scientific).Unter Verwendung von Wasser/0,05 % Ameisensäure als Lösungsmittel wurde die Probe automatisch aufgefangen und mit einer Durchflussrate von 6 µL/min entsalzt.
Die folgenden Gradienten von Wasser/0,05 % Ameisensäure (Lösungsmittel A) und 80 % Acetonitril/0,045 % Ameisensäure (Lösungsmittel B) wurden verwendet, um die Trennung tryptischer Peptide bei einer Flussrate von 300 nL/min zu erreichen: 4 % B für 5 Minuten, dann 30 A linearer Gradient auf 45 % B innerhalb von Minuten und ein linearer Anstieg auf 95 % Lösungsmittel B innerhalb von 5 Minuten.Schließen Sie die Chromatographiesäule an einen Nano-Emitter aus Edelstahl (Proxeon) an und sprühen Sie den Eluenten mit einem Potential von 2.300 V direkt auf die beheizte Kapillare des Massenspektrometers. Damit verbunden ist der Übersichtsscan mit einer Auflösung von 60.000 im Orbitrap-Massenanalysator mit mindestens drei Daten-MS/MS-Scans, dynamisch ausgeschlossen für 30 Sekunden, unter Verwendung einer durch lineare Ionenfallen induzierten Dissoziation oder einer Kollisionsdissoziation mit höherer Energie in Kombination mit Orbitrap-Detektion. Die Auflösung beträgt 7.500.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 03.08.2021